BJS 食品补充检验方法 BJS 202411 谷物碾磨粉及制品、淀粉及制品中 植物源性成分定性检测 2024-12-22发布 国家市场监督管理总局 发布
BJS 202411 谷物碾磨粉及制品、淀粉及制品中 植物源性成分定性检测 1范围 本方法规定了谷物碾磨粉及制品、淀粉及制品中植物源性成分的检测方法.
本方法适用谷物碳磨粉及制品（粉、粒、片及其冲调类制品）、淀粉及制品（粉丝、粉条、藕粉及其冲调 类制品等）中可能含有一种植物源性成分的Sanger基因测序及可能含有多种植物源性成分的高通量基 因测序定性检测.
可鉴别植物物种列表见附录A. 2原理 提取试样中基因组DNA，以DNA为模板，使用植物叶绿体基因（rkL）通用引物进行PCR扩增， 将扩增片段测序后与数据库比对，确定序列所属植物物种，实现样品中植物源物种成分的定性检测.
3试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂.
试验用水符合GB/T6682中一级水的要求.
试剂 均用无DNA酶污染的容器分装.
rbrL-F:5'AATCTTCTACTGGTACATGGAC-3'. rbr L-R :5'-TCATCATCTTTGGTAAAATCAAG-3' rbcL基因片段电泳长度为433bp左右.
3.2试剂 3.2.1十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，CHBrN）.
3.2.2氯化钠（NaCl).
3.2.3二水乙二胺四乙酸二钠盐（NaEDTA2HO，CHNO Na:2HO）. 3.2.4三羟甲基氨基甲烷（Tris，CHNO）.
3.2.5盐酸（HCI) 3.2.6氢氧化钠（NaOH）.
3.2.7十二烷基肌氨酸钠（C;HNNaO）. 3.2.8 RNA 酶 :10 mg/mL 3.2.9蛋白酶K:20mg/mL. 3.2.10苯酚（CH O）. 3.2.11三氯甲烷（CHCI）.
3.2.12 125 mmol/L Na EDTA. 3.2.13乙酸钾（CHKO）.
3.2.14冰乙酸（CHO）.
BJS 202411 3.2.15异丙醇（CHO）.
3.2.16无水乙醇（CHO）.
3.2.17 10 ×PCR 缓冲液:200 mmol/L KCl15 mmol/L MgCl 200 mmol/L Tris • HCI(pH 8.8) 3.2.18Tag DNA聚合酶：2.5 U/uL. 3.2.19无菌水， 3.2.20硼酸（HBO）.
3.2.21琼脂糖（CHO，），电泳级.
3.2.22GelRed核酸染料（10000×）.
3.2.23加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（质量分数）蔗糖水溶液.
3.2.24DNA电泳分子量标准品：50bp~500bp 3.2.25甲酰胺（CHNO）.
3.2.26Sanger基因测序试剂盒：至少包含荧光染料、测序引物、高效测序反应酶、缓冲液.
3.2.27PCR产物纯化试剂盒（磁珠法）：至少包含磁珠、清洗缓冲液.
3.2.28文库构建试剂盒：至少包含连接头、标记标签、T4DNA连接酶、DNA聚合酶、T4多聚核苷酸 激酶、缓冲液.
3.2.29高通量基因测序试剂盒：至少包含测序引物、高效测序反应酶、缓冲液.
3.3试剂配制 4.84gTris（3.2.4），加人约160mL水溶解后，用盐酸（3.2.5）调节pH至8.0，加水定容至200mL， 121℃高压灭菌20 min，备用.
3.3.2裂解液Ⅱl：称取10g十二烷基肌氨酸钠（3.2.7），充分溶解后，加水定容至200mL，121‘C高压灭 菌20 min，备用 3.3.3苯酚-三氯甲烷-异戊醇混合物：苯酚（3.2.10）三氯甲烷（3.2.11）：异戊醇（3.2.12）（2524：1， 体积比）.
3.3.53mol/L乙酸钾溶液（pH5.2）：称取29.4g乙酸钾（3.2.13），加人约80mL水溶解后，用冰乙酸 （3.2.14）调节pH至5.2，加水定容至100mL，使用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，备用.
3.3.670%乙醇溶液：将无水乙醇（3.2.16）和无菌水（3.2.19）按70：30的体积比混合均匀.
3.3.71 mol/L Tris HC1(pH 8.0)：称取 121.1 gTris（3.2.4）溶解于约 800 mL 水中，用盐酸（3.2.5）调 节pH至8.0 加水定容至1000mL，121C高压灭菌20min，备用.
3.3.80.5 mol/L NaEDTA(pH 8.0):称取 18.6 gNaEDTA 2HO(3.2.3)溶解于约 70 mL 水中，用 氢氧化钠（3.2.6）调节pH至8.0.加水定容至100mL，121C高压灭菌20min，备用.
3.3.9 TE 缓冲液(pH 8.0) ;取 1 mol/L Tris • HCl(3.3.7)1 mL 0.5 mol/L NaEDTA(3.3.8)0.2 mL 加无菌水（3.2.19）定容至100mL，备用.
3.3.10dNTP混合液（dATP、dTTP.dGTP、dCTP)：每种脱氧核糖核苷酸各10mmol/L.
3.3.11电泳缓冲液：54 g Tris（3.2.4)，27.5 g硼酸（3.2.20），0.5 mol/L NaEDTA（3.3.8）20 mL，加水 定容至1000mL；使用时10倍稀释.
3.3.12125mmol/L NaEDTA溶液：量取0.5mol/L NaEDTA(3.3.8)25mL 加水定容至100mL 备用.
3.3.1380%乙醇：将无水乙醇（3.2.16）和无菌水（3.2.19）按80：20的体积比混合均匀.
BJS 202411 4仪器和设备 4.1组织研磨仪. 4.2电子天平：感量0.01g 4.3恒温水浴锅：65C士1℃ 4.4高速离心机：离心力≥12500r/min. 4.5核酸蛋白分析仪.
4.6PCR仪.
4.7电泳仪：最大电压≥200V，最大电流≥300mA. 4.8凝胶成像仪， 4.9Sanger基因测序仪.
4.10高通量基因测序仪.
4.11微量移液器(0.5 μL~10 μxL 10 pμL~100 μL 10 μL~200 μL 100 μL~1 00 μL) 4.12涡旋振荡器.
4.13不锈钢筛网：60目（筛网孔径212μm）.
5分析步骤 5.1试样制备 5.1.1粉状样品：直接称取样品进行基因组DNA提取.
5.1.2其他固体样品：取100g样品用组织研磨仪充分粉碎，通过60目不锈钢筛网，取过筛后样品进行 基因组DNA提取.
5.2DNA提取 5.2.1样品裂解方法如下.
谷物碾磨粉及制品（粉、粒、片及其冲调类制品）：取0.1g样品加人2.0mL离心管中，加人1mL裂 蛋白酶K（3.2.9），涡旋混匀，65C孵育0.5h~1h（也可过夜孵育），期间每隔10min涡旋混匀若干次； 孵育结束后，12500r/min离心10min，将上清溶液转移至另一新的2.0mL离心管中.
淀粉、藕粉及其冲调类制品：取0.5g样品加人50.0mL离心管中，加人5mL裂解液I（3.3.1）、 2mL裂解液Ⅱ（3.3.2）、50μLRNA酶（3.2.8)，涡旋混匀，室温静置5min;加人50pL蛋白酶K(3.2.9）， 涡旋混匀，65℃孵育0.5h~1h（也可过夜孵育），期间每隔10min涡旋混匀若干次；孵育结束后， 12500r/min离心10min，将上清溶液转移至另一新的50.0mL离心管中.
粉丝、粉条：取0.5g样品加人50.0mL离心管中，加人8mL裂解液I（3.3.1）、3.2mL裂解液Ⅱ （3.3.2）、50LRNA酶（3.2.8），涡旋混匀，室温静置5min；加人50L蛋白酶K（3.2.9），涡旋混匀， 65“C孵育0.5h~1h（也可过夜孵育），期间每隔10min涡旋混匀若干次；孵育结束后，12500r/min离 心10min，将上清溶液转移至另一新的50.0mL离心管中.
12 500 r/min 离心 10 min. 5.2.3小心吸取上清液转移到另一新的离心管中，加人等体积三氯甲烷-异戊醇混合物（3.3.4），涡旋混 匀，12 500 r/min 离心 10 min. 5.2.4小心吸取上清液转移到另一新的离心管中，加人0.6倍体积异丙醇（3.2.15）和0.1倍体积乙酸钾
BJS 202411 溶液（3.3.5），颠倒混匀，20℃静置沉淀1h，12500r/min离心10min.
5.2.5弃去上清液，用500μL70%乙醇溶液（3.3.6）洗涤沉淀；12500r/min离心1min，弃去上清液， 沉淀室温自然晾干1min~5min.
注：可使用真空离心浓编仪对DNA进行干操处理.
5.2.6将沉淀溶解于20pL~50pLTE缓冲液（3.3.9）中，4C保存备用.
注：可用等效DNA 提取试剂盒提取DNA. 5.3DNA浓度测定 使用核酸蛋白分析仪检测DNA溶液浓度，DNA溶液浓度为5ng/uL~100 ng/μL，适用于本方法.
5.4PCR扩增 反应体系总体积为25.0μL，其中包含：10×PCR缓冲液（3.2.17)2.5pL，上、下游引物各1.0pL（引 物浓度 10μmol/L)，dNTP 混合液（3.3.10)2.0μL，Taq DNA 聚合酶（2.5U)（3.2.18）0.2μL，DNA 模板 10ng~20ng，用无菌水（3.2.19）补足体积至25.0plL.
扩增条件：94℃预变性5min；94℃30s 56℃30s，72℃30s 35个循环；72C延伸10min；4℃ 保存.
需同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照.
以含目标植物源性成分的样品提取的DNA为阳性 对照，以不含目标植物源性成分的样品DNA为阴性对照，以水为空白对照，样品和对照设置两个平行 的反应体系.
注：可使用等效扩增试剂进行PCR扩增.
5.5琼脂糖凝胶电泳 5.5.1制胶 取2.0g琼脂糖（3.2.21），加人100mL电泳缓冲液（3.3.11），加热充分熔化，加人10LGelRed核 酸染料（10000×)(3.2.22)，制胶.
5.5.2电泳 在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶.
将5pLPCR扩增产物（5.4）分别和1gL加样 缓冲液（3.2.23）混合，点样；同时取5pLDNA电泳分子量标准品（3.2.24），点样.
9V/cm恒压电泳，直 至澳酚蓝指示剂迁移至凝胶中部.
用凝胶成像仅观察电泳结果并记录.
注1：可使用其他等效的无毒或低毒染料.
注2：可使用毛细管电泳仪进行电泳检测分析.
5.6DNA测序 5.6.1概述 PCR扩增后，电泳检测，如获得单一扩增条带且样品标签标识仅含有单一植物源性成分，则按照 5.6.2进行Sanger基因测序及分析：如样品标签标识含有多种植物源性成分，或Sanger基因测序时发现 有多峰现象，则都提示为多物种混合样品，则按照5.6.3进行高通量基因测序及分析.
5.6.2Sanger基因测序 5.6.2.1循环测序反应 按 Sanger基因测序仪配套试剂要求进行测序模板制备，配制反应体系进行循环测序反应.
测序模
