BJS 食品补充检验方法 BJS202412 芝麻酱中植物源性成分的测定 2024-12-22发布 国家市场监督管理总局 发布
BJS 202412 芝麻酱中植物源性成分的测定 1范围 本方法规定了芝麻酱中芝廉成分，以及可能存在的花生、大豆和小麦成分的实时荧光PCR定性检 测方法.
本方法适用于芝麻酱中芝麻成分，以及可能存在的花生、大豆和小麦成分的定性检验.
2原理 提取试样中基因组DNA，以DNA为模板，利用物种特异性引物及探针进行实时荧光PCR扩增检 测，根据扩增的C1值，判定试样中是否含有该源性成分.
3试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯.
试验用水符合GB/T6682中一级水的要求.
试剂均用无 DNA酶污染的容器分装.
3.1检测用引物和探针 引物探针序列见表1. 表1引物探针序列 目标物种 引物/探针序列（5→3’） 基因来源 F:TTACCAGAGGGCTAGGGACCTT 芝麻 R:GGTTGATTGCGATTCTACACAAAG 2S albumin mRNA P:FAM-TGCGACCCCAGCAATGCCAA-TAMRA F:GATAGGTTGCAGGGGAGGCA 花生 R:CAACGCTGTGGTGCCCTAAG Aru h2 P:FAM-AGGGAGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCGGC-TAMRA F:GCCCTCTACTCCACCCCCA 大豆 R:GCCCATCTGCAAGCCTTTTT Lectin P;FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-TAMRA F:CAACAATTTTCTCAGCCCCAACA 小麦 R:TCTTGCATGGGTTCACCTGTT GAG56 D P:FAM-TTCCCGCAGCCCCAACAACCGC-BHQ1
BJS 202412 表1引物探针序列（续） 目标物种 引物/探针序列（5→3’) 基国来源 F;TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA 内参照 R: AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT 18S rRNA P;FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC-TAMRA 注：F代表上游引物；R代表下游引物：P代表探针.
3.2试剂 3.2.1蛋白酶K：20mg/ml.
3.2.2 苯酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1.体积比）.
3.2.470%乙醇.
3.2.5Taq DNA聚合酶.
3.2.6 dNTP混合液， 3.2.7 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）.
3.2.8 氯化钠（NaCl). 3.2.9乙二胺四乙酸（EDTA).
3.2.10 三甲基氨基甲烷（Tris） 3.2.11 盐酸（HCI）. 3.2.12 三甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl）.
3.2.13 10 ×PCR 缓冲液;200 mmol/L KCl 15 mmol/L MgCl 200 mmol/L Tris-HCl(pH8.8).
3.3试剂配制 3.3.1 CTAB 缓*液 :55 mmol/L CTAB 1 400 mmol/L NaC1 20 mmol/L EDTA 100 mmol/ L Tris 用10%盐酸调节pH至8.0，121C高压灭菌20min，备用.
3.3.2TE 缓冲液(Tris-HCI EDTA 缓冲液):10 mmol/L Tris-HCI(pH8.0) 1 mmol/L EDTA (pH8.0) 3.3.3苯酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1.体积比）：将苯酚、三氯甲烷、异戊醇按25：2411的体积比 混合均匀.
4仪器和设备 4.1核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.
4.2恒温水浴锅.
4.3高速冷冻离心机：离心力12000r/min.
4.4微量移液器（0 5 yuL~10 pl 10 μL~100 μxL 10 pL~200 μL 100 yL~1 000 μL) 4.5实时荧光PCR仪.
4.6涡旋振荡器.
4.7天平：感量0.01g. 4.8超净工作台.
4.9低温冰箱. 2
BJS 202412 5分析步骤 5.1试样总DNA的提取 样品含油量较大，有明显油和沉淀分离层，避开上面油层，称取下层沉淀部分100mg置于离心管 中，用于核酸提取.
按CTAB法提取样品DNA： a）向称取的样品管中加人1mLCTAB缓冲液（3.3.1）和50pL蛋白酶K（3.2.1）（-20℃保存）， 振荡混匀.65C孵育2h（过夜孵育更好），期间每隔10min振荡混匀； b）加人等体积的苯酚-三氯甲烷-异戊醇（3.3.3），振荡混匀后静置10min，室温下以12000r/min 离心10 min; c）小心吸取上清液于新的离心管中，加入等体积的苯酚-三氯甲烷-异戊醇（3.3.3），重复5.1b） 步骤； d）小心吸取上清液至新的离心管中，加人0.7倍体积的一20℃预冷的异丙醇（3.2.3），振荡混匀， 12000r/min离心5min，弃上清液，保留沉淀； e）在管中加人700μuL的70%乙醇（3.2.4），振荡混匀，12 000r/min离心3min，弃上清液，保留 沉淀： f）重复步骤e）； g）室温晾干沉淀，加人100gL.TE缓冲液（3.3.2）溶解沉淀.
5.2DNA浓度和纯度测定 5.2.1核酸蛋白分析仪 取1LDNA溶液，使用核酸蛋白分析仪检测其浓度及质量，ODs/s值在1.7~1.9之间时，适宜 于 PCR 扩增.
5.2.2紫外分光光度计 检测步骤如下： a）用水在260nm和280nm两个波长校零.
b）将待测DNA溶液做适当稀释，选用光程为0.5的石英比色Ⅲ，测定OD和OD的值.
c)在260nm和280nm分别读出样品的光密度值.
DNA浓度（ng/μL)=OD:×50×稀释 倍数.
d）提取的DNA的OD/z值在1.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增.
注：DNA浓度和纯度测定采用5.2.1或5.2.2的一种方法即可.
5.3实时荧光PCR扩增 反应体系的体积为25gL，体系组成见表2.
表2实时荧光PCR扩增体系组成 总体积 25 yl. 10×PCR缓冲液 5 μL 正向引物(10 ymol/L) 1 μL
BJS 202412 表2实时荧光PCR扩增体系组成（续） 反向引物(10 pmol/L) 1 μL 探针(10 pmol/L) 1 yl dNTPs(10 μmol/L) 2 yl. Taq DNA 聚合酶(2.5 U) 0.2 μl. DNA 模板(10 ng/μL~100 ng/pμlL) 2 yl dd H; O 12.8 μL 实时荧光PCR反应参数随仪器不同可略有改变，一般为50℃2min；95℃15min；95℃15s， 60℃ 1min，40个循环.
检验过程分别设阳性对照、阴性对照、内参对照和提取空白对照.
以分别含芝麻、花生、大豆和小麦 源性成分的样品为阳性对照，以不含芝麻、花生、大豆和小麦源性成分的样品为阴性对照，以真核生物 18SrRNA做内参对照，以无菌水做空白对照.
样品、对照设置2个重复，以Ct平均值作为最终结果.
6结果判定与表述 6.1实时荧光PCR反应质量控制 以下条件有一条不满足时，结果视为无效： a）空白对照：无FAM荧光信号检出，相应Ct值>40.0； b）阴性对照：无FAM荧光信号检出，相应Ct值>40.0； c）阳性对照：有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct值≤35.0； d）内参对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值40.0，则判定为不含相应的植物源性成分： c）如35.0<Ct值≤40.0，则需重复试验，再次扩增后的Ct值仍<40.0，且阴性对照、阳性对照和 空白对照结果正常，则判定该样品含有相应的植物源性成分；再次扩增后结果Ct值≥40.0，且 阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则判定该样品不含相应的植物源性成分. 6.3实时荧光PCR反应结果表述 结果为阳性者，表述为“检出××源性成分”. 结果为阴性者，表述为"未检出××源性成分” 7防污染措施 检测过程中防止交又污染的措施按照GB/T27403中的规定执行.
