ICS67.050 CCS X89 GH 中华人民共和国供销合作行业标准 GH/T1396-2022 松花粉及其制品中松源成分检测 实时荧光PCR法 Identification of pine derived ingredients in pine pollen and its products- Real-timePCRmethod 2023-02-09发布 2023-03-01实施 中华全国供销合作总社 发布
GH/T 1396-2022 前言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草.
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本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由中华全国供销合作总社提出.
本文件由全国蜂产品标准化工作组（SAC/SWG2）归口.
本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中检国控科技集团有限公司、江苏蜂奥生物科技有限 公司、中国蜂产品协会.
本文件主要起草人：杨艳歌、张紫娟、刘鸣畅、吴亚君、王洪越、张羽、谭丽蕊、王迎春、范春林、 黄文胜、李涛、李红娜、张佳琳.
II
GH/T 1396-2022 松花粉及其制品中松源成分检测实时荧光PCR法 1范围 本文件规定了松花粉及其制品中松源成分检测的实时荧光PCR检测方法.
本文件适用于松花粉及其制品中松源成分的定性检测.
本文件的检出限（LOD）为1%（质量分数）.
2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.
其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本 文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 GH/T1030松花粉 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件.
3. 1 花粉pollen 由一个营养细胞和一个至二个生殖细胞组成的显花植物的雄性种质.
[来源：GB/T30359-2021，3.1] 3. 2 松花粉 pine pollen 松花粉为松科植物马尾松PinusmassonianaLamb.、油松Pinus tabulaeformisCarr或同属数种植物的 总服务平 雄性生殖细胞.
[来源：GH/T 1030-2004，3.1] 注：包括采集产品和加工产品.
3.3 实时荧光PCRreal-timePCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始 模板的定量及定性分析.
3. 4 Ct值cycle threshold value
GH/T 1396-2022 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数.
4缩略语 下列缩略语适用于本文件.
bp：碱基对（Base pair） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrithylammonium bromide） dATP：脱氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosine triphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（Deoxycytidine triphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（Deoxyguanosine triphosphate） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（Deoxyribonucleoside triphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（Deoxythymidinetriphosphate） EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid） FAM：羧基荧光素（Carboxyfluorescein） OD：光密度（Optical density） PCR：聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction） TAMRA：双基四甲基罗丹明（Carboxy-tetramethyl-rhodamine） Taq：水生栖热菌（Thermus aquaticus） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane） UNG：尿嘧啶N-糖基化酶（Uracil N-glycosylase） 5方法原理 提取样品DNA并以其为模板，分别以真核生物18srRNA基因和松成熟酶蛋白K（maturaseK，matK） 编码基因设计引物和Taqman探针，以松源DNA为阳性对照，以原核生物DNA为阴性对照，以无菌 水为空白对照，进行实时荧光PCR扩增，通过观察实时荧光PCR的增幅现象，判定样品中是否含有松 源成分.
6试剂和材料 除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求.
试剂均用 无DNA酶污染的容器分装.
6.1检测用引物和探针 松成分和内参基因扩增的引物和探针信息详见表1，松引物扩增的靶标序列见附录A.
表1松花粉中松源成分检测引物探针序列 物种名称 引物/探针序列（5→3） 扩增片段长度 靶基因 内参基因 F:TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA R:AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA 137 bp （真核生物） 18s rRNA P:FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-TAMRA 松 F: GTTCGGACCAAAGATGGAAATAA 271bp matK 2
GH/T 1396-2022 R:TCCCGTCTTAAACGATCCTCTC P:FAM-TCGTTGTCTCATGGATCTTTCCCTCAGC-TAMRA 6.2三氯甲烷（氯仿）.
6.3异丙醇.
6.4蛋白酶K缓冲液.
6.5灭菌水：在103.4kPa（121°C）灭菌20min.
6.6乙醇溶液（70%，VV）.
6.7蛋白酶K（10mg/mL）：在100mg蛋白酶K中加入10mL蛋白酶K缓冲液，分装成1mL/管， -20℃储存.
6.8NaOH溶液（10mmol/L）：在160mL二级水中加入80.0gNaOH溶解后冷却至室温，再用二级 水补充至200mL.
6.9NaEDTA溶液（500mmol/L，pH8.0)：称取18.6gNaEDTA，加入70mL二级水，再加入NaOH 溶液加热至完全溶解后，冷却至室温，NaOH溶液调pH至8.0，加二级水补充至100mL，在103.4kPa （121°℃）灭菌20min.
6.10Tris-HCI溶液（1mol/L，pH8.0）：称取121.1gTris 溶解于 800mL二级水，用HCI调pH 8.0， 加二级水补充至1000mL，在103.4kPa（121°C）灭菌20min.
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6.11CTAB 提取缓冲液（pH 8.0）：称取 4.0 g CTAB，16.364 g NaCI，加入 20 mL 1 mol/L Tris-HCI 溶液（pH8.0），8mL500mmol/LNaEDTA溶液（pH8.0），先用70mL二级水溶解，再补充至200 mL，在103.4kPa（121°C）灭菌20min.
6.12CTAB沉淀液：称取1.0gCTAB，0.467gNaCI，先用70mL二级水溶解，再补充至200mL， 在103.4kPa（121°C）灭菌20min.
6.13实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U~2U（Unit，酶学单位）的Taq酶、1xPCR 缓冲液、2.5mmol / L~4.0mniol / L的Mg²*、0.2 U~1 U的UNG酶、0.2mmol / L的d（A，C G)TPs、 0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料.
也可使用等效的实时荧光PCR预混液.
准信息服务平 7仪器设备 7.1实时荧光PCR仪.
7.2超微量分光光度计或紫外分光光度计.
7.3组织研磨器.
7.4冷冻离心机：离心力≥15000g，制冷范围-20℃~室温.
100~00100~0z100~00~0 7.6恒温混匀仪.
7.7涡旋震荡器.
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