ICS67.180.10 CCS X31 GH 中华人民共和国供销合作行业标准 GH/T1452-2024 蜂蜜中葫芦巴碱含量的测定液相色谱-串 联质谱法 Determinationof trigonellineinhoney- liquid chromatography-tandemmassspectrometrymethod 2024-03-22发布 2024-09-01实施 中华全国供销合作总社 发布
GH/T1452-2024 前言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草.
本文件由中华全国供销合作总社提出.
本文件由全国蜂产品标准化技术委员会（SAC/TC601）归口.
本文件起草单位：秦皇岛海关技术中心、上海冠生园蜂制品有限公司、江苏蜂奥生物科技有限公司、 喀什海关技术中心、厦门喜多多食品销售有限公司、西双版纳金棕生物科技有限公司、福建省产品质量 检验研究院、中国蜂产品协会、武汉安孕堂食品技术开发有限公司.
本文件主要起草人：崔宗岩、温吴松、张孙现、张琴、黄学者、贾英杰、张羽、孙国峰、李文丽、 祖铁红、管志斌、许永生、李娜、贾光群、刘晓茂、张进杰.
GH/T 1452-2024 蜂蜜中葫芦巴碱含量的测定液相色谱-串联质谱法 1范围 本文件规定了蜂蜜中葫芦巴碱含量的液相色谱-串联质谱测定方法.
本文件适用于蜂蜜中葫芦巴碱含量的测定.
2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.
其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本 文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义.
4原理 试样用0.1%甲酸溶液溶解，其中葫芦巴碱经阳离子固相萃取柱提取净化，液相色谱-串联质谱仪测 定，内标法定量.
5试剂和材料 除另有规定外，试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水.
5.1试剂 准信息服务 5.1.1甲酸（CHO2）：色谱纯.
5.1.2甲醇（CHOH）：色谱纯.
5.1.3氨水（NHsHO）.
5.1.4乙睛（CHCN）：色谱纯.
5.1.5乙酸铵（CHCOONH）：色谱纯.
5.2溶液配制 5.2.10.1%甲酸溶液：取1mL甲酸（5.1.1）于1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀.
5.2.22%氨水甲醇溶液：取2mL氨水（5.1.3）于100mL容量瓶中，用甲醇（5.1.2）定容至刻度，混 匀.
5.2.380%甲醇水溶液：取80mL甲醇（5.1.2）于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀.
5.2.45mmol/L乙酸铵溶液：称取0.385g乙酸铵（5.1.5）于1000mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻 度，混匀.
5.3标准品 2
GH/T 1452-2024 5.3.1葫芦巴碱（Trigonelline，CHNO，CAS号：535-83-1，纯度≥99%）.
5.3.2萌芦巴碱-d（Trigonelline-d，CyHDyNO，纯度≥98%）. 5.4标准溶液配制 置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解、稀释并定容，混匀，配制成浓度为1mg/mL的葫芦巴碱标准储 备液，2~8C条件下保存，有效期6个月.
置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解、稀释并定容，混匀，配制成浓度为1mg/mL的葫芦巴碱-d储备 液，2-8°℃条件下保存.
5.4.3葫芦巴碱标准中间溶液：准确移取葫芦巴碱标准储备液（5.4.1）100uL，于10mL容量瓶中，用 80%甲醇水溶液（5.2.3）稀释并定容，混匀后配制成浓度为10μg/mL的葫芦巴碱标准中间溶液，2-8°℃ 条件下保存，有效期3个月.
5.4.4葫芦巴碱-d中间溶液：准确移取葫芦巴碱-d3标准储备液（5.4.2）100uL，于10mL容量瓶中， 用80%甲醇水溶液（5.2.3）稀释并定容，混匀后配制成浓度为10μg/mL的葫芦巴碱-d中间溶液，2~8°℃ 条件下保存.
5.4.5葫芦巴碱标准工作溶液：分别移取湖芦巴碱标准中间溶液（5.4.3）10uL、20uL、50uL、100μL、 200uL、500uL至10mL容量瓶中，并分别加入100guL葫芦巴碱-dg中间溶液（5.4.4），用80%甲醇水 溶液（5.2.3）稀释至刻度，分别配制成浓度为0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、 0.5μg/mL的葫芦巴碱标准工作溶液（葫芦巴碱-dg浓度均为0.1μg/mL），用于绘制标准工作曲线.
标 准工作溶液现用现配.
5.5材料 5.5.1强阳离子固相萃取柱：60mg/3mL，或相当者.
5.5.2微孔滤膜：有机系，规格0.22μm.
6仪器和设备 6.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源.
6.2分析天平：感量0.01g和0.00001g.
6.3涡旋混合器.
6.4固相萃取装置.
6.5氮吹仪.
7试样制备与保存 7.1试样的制备 对无结晶的蜂蜜样品，将其搅拌均匀.
对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60°℃的水浴 中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温.
分出200g作为试样.
制备好的试样置于样品瓶 中，密封，并做上标记.
7.2试样的保存 试样于常温下保存.
8测定步骤
GH/T 1452-2024 8.1提取 称取蜂蜜样品2g（精确至0.01g）至烧杯中，加入适量0.1%甲酸溶液溶解并转移至50mL容量瓶 中，用0.1%甲酸溶液冲洗烧杯两次并转移至容量瓶中，定容，混匀.
含量超出线性范围的样品需适当 倍数稀释.
然后取1.0mL溶液于样品瓶中，向其中加入10uL葫芦巴碱-d中间溶液（5.4.4），混匀后 待固相萃取净化.
8.2净化 强阳离子固相萃取柱（5.5.1）依次用3mL甲醇活化和3mL水平衡，上述加入内标的提取液上样 至固相萃取柱，依次用3mL水和3mL甲醇淋洗，抽干，用3mL2%氨水甲醇溶液（5.2.2）洗脱.
收 集洗脱液，50°C条件下氮气吹干.
加入80%甲醇水溶液（5.2.3）1mL，涡旋1min溶解残余物，微孔 滤膜（5.5.2）过滤，液相色谱-串联质谱仪测定.
8.3测定 8.3.1液相色谱参考条件 a)色谱柱：HILIC柱（2.1mm×100mm，1.7μm），或相当者； b)流动相：A相为乙睛（5.1.4），B相为5mmol/L乙酸铵溶液（5.2.4），梯度洗脱条件见表1； c)流速：0.3mL/min： d)柱温：40°℃； e)进样量：2L.
表1梯度洗脱条件（A：乙睛；B：5mmol/L乙酸铵溶液） 时间（min） 流速（mL/min） A（%) B (%) 0.0 0.3 90 10 0.5 0.3 06 OT 1.5 0.3 50 50 3.5 0.3 50 50 4.0 0.3 90 10 6.0 0.3 90 10 8.3.2质谱参考条件 a)离子源：电喷雾离子源（ESI）； b）扫描方式：正离子扫描： c)检测方式：多反应监测（MRM），葫芦巴碱和葫芦巴碱-d的MRM参数见表2； d)离子源温度：120°℃； e)脱溶剂温度：350°℃： f)脱溶剂气体流速：650L/h： 9)毛细管电压：3kV. 表2葫芦巴碱及葫芦巴碱-d的多反应监测（MRM）参数 化合物名称 定性离子对 定量离子对 锥孔电压 碰撞能量 （m/z) (m/z) (V) (eV) 葫芦巴碱 138.0/78.0 138.0/92.0 50 22 138.0/92.0 20 葫芦巴碱-ds 141.0/97.1 141.0/95.1 50 20 141.0/95.1 20 4
