ICS 67.050 CCS X 10 团 体 标 准 T/CIFST 020-2024 食品用菌种检验 鼠李糖乳酪杆菌检验 PMA-qPCR法 Examination ofmicrobial food culture-Detection of Lacticaseibacillus rhamnosus PMA-qPCRmethod 2024-04-01发布 2024-04-01实施 中国食品科学技术学会 发布
T/CIFST020-2024 前言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由中国食品科学技术学会提出并归口.
本文件起草单位：中国食品发酵工业研究院有限公司、国家食品安全风险评估中心、汤臣倍健股份 有限公司、山西大学、发酵行业生产力促进中心、丹尼斯克（中国）有限公司、内蒙古伊利实业集团股份 有限公司、内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司、光明乳业股份有限公司、北京科拓恒通生物技术股份 有限公司、微康益生菌（苏州）股份有限公司.
本文件主要起草人：姚票、郭立峥、徐进、赵溪、迮晓雷、张国华、刘艺茹、冯会粉、葛媛媛、郭茸凯、 路春霞、马霞、王玉琼、张旭光、毛跃建、张锋华、马杰、方曙光、夏九学.
T/CIFST 020-2024 食品用菌种检验鼠李糖乳酪杆菌检验PMA-qPCR法 1范围 本文件规定了食品中鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacilus rhamnosus）的 PMA-qPCR检验方法.
本文件适用于食品原料和固体饮料中鼠李糖乳酪杆菌的活菌定量检验.
2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.
其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于 本文件.
GB4789.35-2023食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件.
3. 1. 1 实时荧光定量PCRquantitative real-time polymerase chainreaction 在聚合酶链式反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，对未知模板 DNA进行定量分析的方法.
3. 1. 2 Ct值cycle threshold value 实时荧光定量PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定阔值时所经历的循环数.
3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件.
CFU：菌落形成单位（colony forming units) DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） LED：发光二极管（light emitting diode) OD：光密度（optical density) PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） PMA：叠氮澳化丙锭（propidium monoazide) qPCR：实时荧光定量 PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction) ROX：-种荧光染料（carboxy-X-rhodmine）
T/CIFST 020-2024 4原理 PMA是一种能与DNA结合的光反应染料，可透过受损细胞膜与菌体DNA发生共价交联，从而 抑制受损菌体DNA的gPCR扩增.
样品经PMA染料处理，DNA提取后，采用鼠李糖乳酪杆菌特异性 获得样品中鼠李糖乳酪杆菌的活菌数量.
5仪器设备 5.1实时荧光定量PCR仅.
5.2高速台式冷冻离心机：0~20000r/min 5.3酶标仪， 5.4恒温培养箱：36℃±1℃.
5.5生物安全柜或超净工作台.
5.6冰箱：2℃~5℃、-30℃~-20℃C.
5.7涡旋振荡仪， 5.8LED光解仪：最大功率60 W，频率50Hz~60 Hz，LED输出波长465nm~475 nm.
5.9珠式样品研磨器：速度0.8m/s~8m/s. 5.10拍打式均质器.
5.11高压灭菌锅.
5.12天平：精度0.01g.
5.13微量可调移液器及配套吸头0.5μl~10μL、10pL~100yL、100yL~1000L 6试剂或材料 除特别说明外，仅使用分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T6682中一级水.
6.1无菌均质袋.
6.2无菌离心管：1.5mL. 6.3无菌玻璃珠：粒径0.1mm.
6.4无菌研磨管：2ml.
6.5荧光定量PCR8连排管或96孔板.
6.696孔细胞培养板.
6.7MRS（Man Rogosa Sharpe）琼脂培养基：见GB4789.35-2023附录A中A. 2. 6.8PMA溶液：浓度20mmol/L. 6.9无菌超纯水或无菌双蒸水.
6.100.85%无菌生理盐水：见GB4789.35-2023附录A中A.8. 6.11实时荧光定量PCR混合试剂.
6.12ROX参比染料（50×）.
6.13阳性对照：鼠李糖乳酪杆菌CICC6224（=ATCC7469）菌株DNA或扩增片段的阳性克隆分 子 DNA 2
T/CIFST 020-2024 7检测步骤 7.1样品制备及前处理 7.1.1按照GB4789.35-2023中6.1规定的方法将待检测样品制备成1：10的样品匀液.
7.1.2采用微量移液器，以无菌操作吸取7.1.1制备的1：10样品匀液200pL注入96孔细胞培养板 中，利用酶标仪测定样品OD值.
将1：10样品匀液稀释至OD值为0.3~0.5时，总菌体数量约 为10 CFU/mL. 7.1.3吸取10CFU/mL样品匀液500gL，注于1.5mL无菌离心管中.
7.2样品PMA处理 7.2.1在避光条件下，以无菌操作吸取PMA溶液1.25xL，注于7.1.3的离心管中，颠混匀至少10 次，制成PMA终浓度为50μmol/L的样品溶液.
7.2.2将样品溶液置于暗处，室温孵育5min，每隔1min颠倒混匀一次.
7.2.3将样品溶液置于LED光解仪内，曝光照射15min.曝光结束后于室温下12000r/min离心 15 min，弃上清液.
7.3样品DNA提取 7.3.1吸取无菌超纯水200uL.注于7.2.3的离心管中，反复吹吸使之混匀， 7.3.2吸取7.3.1中的全部菌液，注于装有0.25g无菌玻璃珠的2mL无菌研磨管中.
7.3.3将无菌研磨管置于珠式样品研磨器中.以6m/s破碎速度破碎12s.于室温下12000r/min 离心15min，获得DNA粗提液.
取50gL上清液，注于1.5mL无菌离心管中贮存备用.
或采用具有 相同效果的基因组DNA提取方法进行DNA提取.
7.4实时荧光定量PCR扩增 7.4.1实时荧光定量PCR反应体系 实时荧光定量PCR反应体系总体积为25L，其中含：实时荧光定量PCR混合试剂（2X）12.5 反应体系应设置至少3个平行反应.
实时荧光定量PCR检测特异性引物序列分别为：上游引物Lrh- F :5'-TGCTTGCATCTTGATTTAATTTTG-3' F 游 I物 Lrh-R; 5'-GGTTCTTGGATYTATGCG GTATTAG-3，目标基因产物约为122 bp.
注：反应体系中各试别的量根据具体情况或不同的反应总体积作适当调整.
7.4.2实时荧光定量PCR反应程序 实时荧光定量PCR反应程序为：95℃/30s；95C/10s，55C/32s（收集荧光信号）.72C/25s 进行40个循环.
注：反应程序根据不同型号实时荧光PCR仪和所选PCR扩增体系不同作适当调整.
7.4.3实验对照 实验设立以下对照.
阳性对照：鼠李糖乳酪杆菌CICC6224（=ATCC7469）菌株DNA或扩增片段的阳性克隆分 子 DNA.
阴性对照：非鼠李糖乳酪杆菌DNA. 空白对照：无菌超纯水.
