ICS13. 020. 01 CCS D00/09 T/GRM 中关村绿色矿山产业联盟团体标准 T/GRM100-2024 深色有隔内生菌胞外聚合物生产工艺规范 Production Process Specifications for Extracellular Polymeric Substances of Dark Septate Endophytes 2024-12-23发布 2024-12-24实施 中关村绿色矿山产业联盟 发布
T/GRM 100-2024 目次 前言 1范围.. 2规范性引用文件 3术语和定义. 3.1菌种选择， 3.2培养基的配制 3.3培养基优化配制 3.4培养条件. 3.5提取与纯化 3.6冻干粉胞外聚合物制备方式， 3.7 液态胞外聚合物制备方式.
3.8胶囊胞外聚合物的制备方式. 3.9产品形式与储存 4检验与质量控制.
4.1深色有隔内生菌胞外聚合物产量， 4.2深色有隔内生菌胞外聚合物成分组成 4.3深色有隔内生菌胞外聚合物外观质量测定 5安全与环保要求， 6产品包装、运输标识 6.1产品包装. 6.2运输标识要求 附录A（规范性） 胞外聚合物官能团的测定.
A.1方法提要， A.2仪器. A.3分析步骤 A.4结果计算， A.5允许差.
T/GRM100-2024 前言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草.
本标准适用于深色有隔内生菌胞外聚合物的生产过程，旨在规范生产工艺，确保产品质量，满足矿 山生态修复、农田土壤改良和环境治理工程等领域的实际需求.
通过对培养条件、生产工艺、产品质量 控制及安全管理的系统规范，为胞外聚合物的产业化应用提供了技术指导.
本文件由中关村绿色矿山产业联盟提出并归口.
本文件起草单位：西安科技大学西部矿山生态环境修复研究院、中国矿业大学（北京）矿山生态修 复研究院、天山实验室、北京合生元生态环境工程技术有限公司.
本文件主要起草人：毕银丽、彭苏萍、谭海、张士双、解琳琳、赵静、白雪蕊、武超、肖礼、张延 旭、柯增鸣、王坤、全文智
T/GRM 100-2024 深色有隔内生菌胞外聚合物生产工艺规范 1范围 本标准规定了由深色有隔内生菌合成胞外聚合物的技术要求，包括菌种选择、培养基配制、培养条 件、生产过程控制、产品收集与纯化、质量检测、产品包装标识、运输标识等要求.
本文件适用于以微 生物为生产主体的胞外聚合物工业化生产工艺流程.
2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.
其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本 文件.
HJ/T415-2008环保用微生物菌剂环境安全评价导则 GB4789.2-2022食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定 GB19489-2008实验室生物安全通用要求 GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备 GB4789系列标准检测产品微生物安全性 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件.
3.1菌种选择 生产菌种为深色有隔内生菌Alternariasp.17463，为安全、可控的微生物.
在矿区生态修复领域 已取得较好的生态修复效应.
该菌种经过于中国西北内蒙古自治区锡林浩特市胜利露天矿土壤中分离、 鉴定和筛选，并符合相关生物安全要求.
3.2培养基的配制 活化培养基主要成分包括：将土豆切成小块放入锅中，加水1000mL加热至沸腾，维持20-30min， 经8层纱布过滤，保留上清.
加入葡萄糖20g，琼脂18g，121℃灭菌20min.
种子培养基主要成分包括：蔗糖10g/L、麦芽提取物10g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾1g/L、 硫酸镁0.45g/L及维生素B10.02g/L，pH7.0，121C灭菌20min.
发酵培养基主要成分包括：蔗糖30g/L、麦芽提取物25g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾1g/L、 硫酸镁0.45g/L及维生素B10.02g/L，pH7.0，121C灭菌20min.
3.3培养基优化配制 葡萄糖替换为蔗糖，浓度从10g/L提高至30g/L，麦芽提取物浓度从10g/L提高至25g/L，硫酸镁 浓度从0.25g/L提高至0.45g/L，磷酸氢二钾浓度从0.5g/L提高至2g/L，磷酸二氢钾浓度从0.5g/L 提高至1g/L，pH从6.0提高至7.0.
该配比条件下，确保了深色有隔内生菌的生物量和胞外聚合物的产 量和质量.
3.4培养条件 3.4.1活化培养条件 取约5mm的菌饼于活化培养基28C培养7-10天.
确保菌饼底部为黑色，顶部菌丝为白色.
菌株传 代次数应控制在20代以内.
3.4.2种子培养条件
T/GRM 100-2024 取约5mm的菌饼接种于装有200mlL种子培养基的500mlL锥形瓶中，28℃，180r/min培养2天，使该 菌株生长至对数生长期.
3.4.3发酵培养条件 将培养好的种子接种于装有7L发酵培养基的101发酵罐中，接种量为10%，初始搅拌转速为400 r/min（提高发酵液溶氧，便于菌体的快速增长），6h-120h搅拌转速设置为300r/min（降低转速减 少搅拌桨对菌体的损伤），罐体压力为0.05MPa，共培养5天，发酵结束后发酵液较为粘稠，菌丝量较 大，发酵液与菌丝较难分开.
可采用分批发酵、流加发酵或连续发酵工艺，具体选择视规模和生产需求 面定.
3.5提取与纯化 发酵液通过离心、沉淀（如酒精沉淀法）或膜分离技术进行粗提.
进一步纯化可采用超滤、柱层析 等方法，根据应用需求确定纯化程度.
3.6冻干粉胞外聚合物制备方式 烘干法应严格控制温度.
烘干法和冻干法两种制备方法得到胞外聚合物结构组成一致.
3.6.1烘干法 将提纯后的胞外聚合物絮状沉淀放置于烘箱中，45℃烘干至恒重，并通过破碎机破碎为粉末状，便 于溶解使用.
3.6.2冻干法 将提纯后的胞外聚合物放置于冷冻干燥机中，冷凝器设置温度为-80℃，真空度小于10Pa，脱水24 h后使用破碎机破碎为粉末.
3.7液态胞外聚合物制备方式 将胞外聚合物溶于水后振荡，使胞外聚合物完全溶于水中.
制备浓度和体积可根据实际施用需求、 方式和地点而定.
3.8胶囊胞外聚合物的制备方式 将烘干或冻干研磨后的胞外聚合物粉末使用胶囊机制成胞外聚合物胶囊，胶囊逼水可以降解，缓释 出胞外聚合物，每个胶囊胞外聚合物含量约0.2g，密封防潮吸水.
3.9产品形式与储存 最终产品可为胞外聚合物冻干粉、胶囊或液态（溶于水），储存条件应避免高温、高湿等条件.
推 荐储存温度：液态胞外聚合物2-8°C，胞外聚合物冻干粉或胶囊产品可室温保存，需配制干燥剂.
避 免胞外聚合物保存在45℃以上和0℃以下，空气湿度超过40%的条件中.
4检验与质量控制 4.1深色有隔内生菌胞外聚合物产量 采用干重法计量.
4.2深色有隔内生菌胞外聚合物成分组成 功能基团：采用红外光谱分析，参照附录A.
4.3深色有隔内生菌胞外聚合物外观质量测定 采用目视检测法和扫描电镜观测法执行，研磨后的胞外聚合物为粉末状，扫描电镜200倍下为絮状 结构.
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