ICS 65.020.30 CCS A 031 T/NAIA 团体标准 T/NA1A0311-2024 支原体中西药MIC检测标准操作规程 Standard OperatingProceduresforMICDetectionof Mycoplasmain Traditional ChineseandWesternMedicine 2024-10-02发布 2024-10-20实施 宁夏化学分析测试协会发布
前言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.
本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口.
本文件起草单位：宁夏农林科学院动物科学研究所、银川市畜牧技术推广服务中心、西吉县动物疾病 预防控制中心、同心县科技局、隆德县动物疾病预防控制中心、固原市畜牧技术推广服务中心、平罗县农 业农村局.
本文件主要起草人：郭亚男、王小龙、曹晓真、王建东、梁小军、邵喜成、伏耀明、马科、谢文青、 摆世林、于有利、张久盘、张奎举、谢建亮、李毓华、岳康、王鑫、牛晓昊.
T/NA1A 0311-2024 支原体中西药MIC检测标准操作规程 1范围 本文件规定了支原体中药和西药最小抑菌浓度检测技术的术语和定义、原理、标准操作规程、结果判 断依据和操作注意事项.
本文件适用于鸡、牛和羊支原体.
2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件.
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB18597危险废物贮存污染控制标准 CLSIM100-S22 抗生素敏感性检测操作标准 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准.
3. 1 支原体mycoplasma 柔膜体纲、支原体目、支原体科、支原体属中的成员，结构较简单，无细胞壁，没有细胞核，仅有核 糖体.
3.2 最小抑菌浓度minimuminhibitory concentration（MiC) 一种在特定环境下孵育24小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑菌浓度， 用于定量测定体外抗菌活性.
3.3 颜色变化单位color changeunit（CCU） 以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数微生物的相对含量的计数单位.
3.4 胸膜肺炎样微生物培养基pleuropnenmonia-likeorganismmediumPPLO 即支原体培养基，主要用于多种支原体的分离和培养.
T/NA1A 0311-2024 4原理 支原体在PPLO培养基中生长产酸，将导致培养基颜色由红色变为黄色.
当药物在培养基内能够对支 原体的生长起到一定的抑制或杀灭作用时，培养基将维持红色.
将药物进行倍比稀释测定支原体对药物的 敏感性.
药物完全抑制支原体生长的最高稀释管1mL所含的药量，即为最小抑菌浓度（MIC），亦即被测 支原体对该药的敏感度.
5操作程序 5.1仅器与耗材 生物安全柜，二氧化碳培养箱，旋转蒸发仪，电磁炉，0.2mL无菌12连管，2mL无菌EP管，涡旋仪， 冰箱，天平，高压消毒锅，移液器及枪头，0.22μ微孔滤膜.
5.2操作步骤 5.2.1药液的制备 5.2.1.1西药配置 根据药物特性，用相应溶剂将抗菌药物溶解，然后用去离子水将药物稀释成1mg/mL的储存液，～80℃ 保存.
使用前将储存液使用去离子水稀释至所需工作液浓度，0.22m滤膜过滤，4℃保存备用.
不同药物 配置参照CLSIM100-S22执行.
5.2.1.2中药配置 首先以10倍量水浸泡0.5h，大火沸腾后文火煎煮40min，过滤，保存滤液：滤渣再以8倍水量大火 沸腾后文火煎煮30min，过滤，合并两次滤液，将滤液浓缩制成生药含量为1g/mL的浓缩液，-80C保存.
使用前将储存液使用去离子水稀释至所需工作液浓度，0.22m滤膜过滤，4C保存备用.
5.2.2菌株复苏、传代及CCU的测定 5.2.2.1将保存于-80℃含30%甘油的分离鉴定的支原体菌株的菌液吸取100叫L接种于PPL0液体培养基中， 置于37C培养箱中进行复苏，培养48h～72h后吸取100叫L菌液接种于PPL0液体培养基中进行传代培养， 并测定菌株培养后的CCU.
5.2.2.2将支原体菌液用倍比稀释法稀释成1×101～1×1011倍比稀释液（共11管，第12管为对照），于 37℃培养箱培养7d，以培养基由红色变为橙黄色时的最高稀释度作为颜色改变单位CCU，菌液浓度以 CCU/mL 计算.
T/NA1A 0311-2024 5.2.3最小抑菌浓度的测定 5.2.3.1菌液配置 通过倍比稀释将菌株稀释到103～10CCU/mL.
因无支原体耐药性标准菌株不同药物耐药性标准，因此 可以选用大肠杆菌或金黄色葡萄球菌（ATCC）国际标准菌株为阳性参考模式菌株.
避免假阳性的出现、试 验操作误差及错误判断.
5.2.3.2药物配置及操作 依据CLSI标准配置不同药物浓度，按照药物浓度进行药物敏感性测定（MIC）.
在12连排管内，第2 管～12管每管加入100uLPPL0液体培养基，第1管加入100uL工作浓度的抗菌药，从1管中取100口L 至第2管混匀，依次倍比稀释至第10管，弃去100口L，使每管体积相同.
第1～10各管加入100uL预 先稀释好的菌液：第11管加入100ulL菌液作为阳性对照：第12管不加菌液，作为阴性对照.
每个样品3 个重复.
将12连排管盖密封，置于37℃培养箱中培养48h，在不同时间观察每个孔内颜色的变化并记录， 并与阳性对照和阴性对照比较，不发生颜色变化的最小药物浓度为MIC（ug/mL）.
5.2.3.3结果测定 对受试细菌按测得的MIC值水平从低往高计算累积分布频数，然后计算累积分布率，最终测到MIC50 和 MIC90.
5.2.4数据处理 采用SPASS软件对支原体菌株耐药性结果进行统计分析.
5.3结果判定 根据西药和中药的MIC值，将支原体对药物的敏感性分为敏感（Susceptible，S)、中度敏感 (Intermediate，I)和耐药（Resistant，R），判断值参见附录C表C.2.当质控菌株对各药物表现敏感时， 检测结果有效：根据临床分离菌株的MIC值，确定支原体临床分离株的药物敏感性种类.
5.4实验废弃物的处理 将实验所用的固体和液体废弃物分别集中收集到专用容器内，均按《医疗废物管理条例》进行121°℃、 30min高压灭菌处理.
含抗生素的试验废弃物，按GB18597标准中的相关要求进行收集和贮存，由具有资 质的专业机构进行收集、转移和处理.
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