ICS 11.220 SN CCS B 41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5670-2024 饲料中反刍动物、禽及鱼源性成分液相芯片 检测方法 Suspended bead based detection method for ruminant poultry and fish ingredients in feed and feedstuff 2024-12-31发布 2025-07-01实施 中华人民共和国海关总署发布
SN/T 5670-2024 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草.
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本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口.
本文件起草单位：中华人民共和国广州海关、中华人民共和国上海海关、广州维佰生物科技股份有 限公司、中华人民共和国杭州海关.
本文件主要起草人：陈茹、梅明珠、高小博、张强、刘志玲、郭鹏举、伍绮文、段燕喻、林志雄、吴晓薇、 李春红、帅江冰、裘慧.
SN/T 5670-2024 饲料中反当动物、禽及鱼源性成分液相芯片 检测方法 1范围 本文件描述了饲料中反当动物、禽及鱼源性成分检测的液相基因芯片方法.
本文件适用于饲料中反当动物、禽及鱼源性成分的定性检测.
2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于 本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T20190-2006饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应（PCR）法 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件.
3.1.1 荧光强度中位值medianfluoresence intensity 液相芯片检测仪识别每颗微球的编码号及其表面的荧光强度，检测时，软件根据编码号将微球分 类，对每一类编码号微球取预先设定的数量并按其表面的荧光强度进行排序，取其荧光中位值作为该编 码号微球的检测值，即荧光强度中位值.
3.1.2 阔值cutoff value 判定检测阳性信号的最低荧光强度中位值.
3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件.
COI：细胞色素氧化酶 I(Cytochrome oxidase subunit I) CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（Cetyltrithylammonium bromide） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonuleic acid) EDC：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐[1-Ethyl-3-（3-Dimethylaminopropyl）carbo- diimide hydrochloride] EDTA;乙股胺四乙般(Ethylene diaminetetraacetic acid) HPLC:高效液相色谱（High-performance liquid chromatography)
SN/T 5670-2024 MES;2(N码基) 乙磺酸[2-(N-Morpholino)ethanesulfonie acid] MF1：荧光强度中位值（Medinn fluoresence intensity） PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis） PCR；聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction） rRNA：核糖体核糖核酸（Ribosomal ribonucleic acid) SAPE：链霉亲和素枣红蛋白（Streptavidin-phycoerythrin) SDS：十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate) Taq ：水生栖热菌（Thermus aqaatic) TMAC;氯化四甲基胺(Tetramethylammonium chloride) 4技术原理 液相芯片技术以直径约6um的微球为基质进行检测分析.
微球悬浮于液相体系中，构成液相芯 片检测系统，液相基因芯片检测方法通过基于微球的核酸杂交技术并联合流式细胞技术，对样品中的靶 基因进行检测.
每种微球都有一个独特的荧光编码号，每种编码微球表面通过偶联反应固定一种特异 探针，按碱基配对原理与样品核酸的扩增产物特异结合，事先通过采用标记引物使扩增产物带有生物素 基团：使杂交产物与SAPE进行反应产生报告荧光，随后利用液相芯片检测仪对微球进行荧光编码识 别和荧光反应信号检测.
本文件采用液相基因芯片检测方法原理，分别以反当动物线粒体基因组中的16SrRNA、禽线粒体 基因组中的COI基因、鱼线粒体基因组中的12SrRNA保守区为靶标，采用反当动物通用引物和探针 （覆盖黄牛、水牛、耗牛、绵羊、山羊、鹿、骆驼）、禽通用引物和探针（覆盖鸡、鸭、鹅、鸽、火鸡、鸭骋、鹉鸽） 和鱼通用引物和探针，进行反当动物、禽及鱼共3大类动物源性成分的检测鉴定，但不区分每种大类内 具体物种.
采用三重液相芯片方法，可实现同步鉴别检测反当动物、禽及鱼源性成分.
5设备与耗材 5.1液相芯片检测仪.
5.2PCR仪.
5.3台式高速冷冻离心机：离心速度不低于12000r/min.
5.4超净工作台.
5.5涡旋振荡仪.
5.6超声仪.
5.7恒温混匀仪.
5.8机械搅拌器、均质仪，或研磨装置.
5.9天平：感量0.1mg.
5.10微量核酸蛋白分析仪，或紫外分光光度计.
5.11摇床.
5.12磁力架.
5.13聚苯乙烯微孔板.
5.14可调微量移液器及带滤芯吸头：0.5pL~10μL、10L~100L、20L~200L、200L~ 1 000 μl 2
SN/T 5670-2024 5.15微量离心管：1.5ml.
5.16PCR反应管.
6试剂 6.1除另有规定外，试剂均为分析纯.
试验用水符合GB/T6682中二级水的要求.
6.2微球：采用胶基化非磁性微球（MicroPlex beads)，或鞍基化磁性微球（MagPlex beads）.
6.3扩增引物和探针，各条下游引物的5'端均标记生物素（biotin），HPLC纯化：各条探针的5'端均 C12标记氨基（AmM），HPLC纯化：上游引物采用PAGE纯化.
反当动物、禽和鱼源性成分特异扩增 引物和探针序列见表1.
采用无核酸酶超纯水将每条引物配制成100μmol/L储存液，置一20C以下 冻存，使用时，根据表2，取适量配制成5μmol/L或10pmol/L工作液，避免多次冻融.
用无核酸酶超 纯水将每条探针配制成100μmol/L溶液，直接使用，剩余探针液置一20C以下冻存，避免多次冻融.
表1扩增引物与探针序列 类别 引物探针序列（5'-3）与标记 上游引I物 Rum F:TGGTTGTOCAGAAAATGA 反当动物 下引物 Rum R: biotin-TGTACCTTTTTAGACTAACTT 探针: AmM C12-TTCAGCTTTAAA(G/A)ATACCAAAA 上游引物 Avi F1;CTAACAGGAATCGTCCTTGC 上游引物 Avi F2:CTAACAGGAATTGTCCTCGC 下游引物 Avi R: biotin-GTGAATCCTGCTAGGATGGC 探针:AmM C12-GTAGTCGCCCACTTCCACTA 上游引物 Fis F:AGGAGCCTGTTCTAGAAC 鱼 下游引物 Fis R;biotin-TTCACAGGGTAAGCTGAC 探针: AmM C12-TTTTTTTTTTTTCCCCGTTAAACCTCACC 6.4热启动 Taq DNA聚合酶.
可采用Promega GoTaq Hot Start Polymerase”或其他等效产品.
6.5无核酸酶超纯水， 6.6无水乙醇.
6.7MES溶液：配制方法按附录A中A.1.
6.8TMAC溶液：1.5×TMAC配制方法按A.2.1×TMAC配制方法按A.3.
6.9EDC溶液：配制方法按A.4. 6.100.02%Tween-20：配制方法按A.5. 6.110.1%SDS：配制方法按A.6. 6.12TE缓冲液：配制方法按A.7.
6.13 SAPE. 1）该热启动酶由Promega公司生产.
给出这一信息是为了方便本文件的使用者，并不表示对该产品的唯一认 可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品，
