ICS 11.220 SN CCS B 41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5671-2024 猪圆环病毒2型和3型荧光PCR检测方法 Detectionmethod of fluorescentPCRforporcine circovirus2and 3 2024-12-31发布 2025-07-01实施 中华人民共和国海关总署发布
SN/T 5671-2024 前言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草.
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本文件起草单位：中华人民共和国天津海关、韶关学院、中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国 石家庄海关、中华人民共和国大连海关、中华人民共和国成都海关.
本文件主要起草人：陈小金、赵丹、刘立兵、帅江冰、张俊哲、张晓峰、董志珍、张霞、陈世界、王建昌、 肇慧君、王金风、林华.
SN/T 5671-2024 猪圆环病毒2型和3型荧光PCR检测方法 1范围 本文件描述了猪圆环病毒2型和3型的实时荧光PCR及数字PCR检测方法.
本文件适用于猪圆环病毒2型和3型的实验室检测.
2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 GB19489实验室生物安全通用要求 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件.
3.1.1 检测限limitof determination；LOD 线性动态范围内，数字PCR方法所能检测样品中病毒的最低拷贝数浓度.
3.1.2 定量限limit ofquantification：LOQ 线性动态范围内，平行组相对标准偏差不超过25%的精度条件下，数字PCR方法所能定量测定的 样品中病毒的最低拷贝数浓度.
3.1.3 微反应体系tinyreaction system 将含有模板、引物/探针、Taq酶及其缓冲液充分混匀后分配至体积相同且相互物理隔离的油包水 液滴或其他微孔、微室中所形成的小体积荧光PCR反应体系， 3.1.4 过程质控物质processcontrol 通过添加与目的病毒类似的外源质控物质，来监测整个检测过程，通过对最终过程质控物质回收率 的计算来评估检测过程的有效性和计算样品中病毒的实际含量.
3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件.
BC 空白对照（blank control) bp 碱基对（base pair）
SN/T 5671-2024 Ct 循环闽值(eycle threshold) DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） dPCR 数字PCR（digital PCR） EPC 外源过程质控（externalprocess control) F-PCR 荧光PCR（fluorescent PCR) NC 阴性对照（negative control) PC 阳性对照（positive control) PCR 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） PCV2 猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2） PCV3 猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3） qPCR 实时荧光PCR（real-time PCR） 4仪器和设备 4.1Ⅱ级生物安全柜.
4.2实时荧光PCR扩增仪.
4.3高速台式冷冻离心机（角转子；24×1.5mL，12×15ml;13000r/min）.
4.4微量核酸蛋白测定仪.
4.5微量移液器(0 5 pL~10 pμL，2 μL~20 μL 20 pL~200 μL 100 xL~1000 μL) 4.6组织匀浆仪.
4.7高压灭菌器.
4.8数字PCR系统：包括微反应体系发生器和微反应体系荧光检测仪.
5试剂和材料 5.1水：符合GB/T6682规定的一级水.
5.2灭菌生理盐水：配制应符合A.1的要求.
5.33mol/LNaOAc溶液：配制应符合A.2的要求.
5.4磷酸盐缓冲液（PBS）：配制应符合A.3的要求 5.5无核酸酶水：配制应符合A.4的要求.
5.6DNA提取试剂：CTAB裂解液、蛋白酶K溶液（20mg/mL）、Tris饱和酯、三氯甲烷、异丙醇、无水 乙醇.
5.72×PCR预混反应液（probeqPCR） 5.8质控物质：阳性质控品用符合要求或具备一定资格单位提供的含PCV2和PCV3DNA的组织样 品或质粒（序列参考信息见附录B中B.2~B.5）；阴性质控品为不含PCV2和PCV3的组织或血液.
5.9荧光PCR扩增管或反应板、数字PCR微反应体系生成联排管及覆膜或芯片， 5.10无核酸酶离心管.
5.11数字PCR反应预混液.
5.12引物和探针：引物探针序列见表1，扩增序列的信息见附录B.
SN/T 5671-2024 表1引物探针序列信息 方法 病毒 引物名称 序列 扩增片 段长度 PCV2-qF(上游引物) GARACTAAAGGTGGAACTGTACC PCV2-qF2(上游引物) CGGGCTGGCTGAACTTTTG PCV2-qR（下游引物） TCCGATARAGAGCTTCTACAGC 118 bp PCV2 PCV2-qR2（下游引物） CCAGGTGGCCCCACAAT 87 bp PCV2-qP(探针) HEX-AGGAGTACCATTCCAACGGGG-BHQ1 PCV2-qP2<探针) HEX-TCACGCTTCTGCATTTTCCCGC-BHQ1 PCV3-qF(上游引物) GGTGAAGTAACGGCTGTGTTTT 实时荧 PCV3-qF2（上游引物） TATAATGGGGAGGGTGCTGT 光 PCR PCV3 PCV3-qR(下游引物） ACACTTGGCTCCARGACGAC 86 bp PCV3-qR2(下游引物） CCCCAATTCTCAGCAATTCA 76 bp PCV3-qP(探针) FAM-ATGCGGAAAGTTCCACTCGK-BHQ1 PCV3-qP2(探针） FAM-TGATTTTTATGGGTGGGTTCCATTT-BHQ1 IC-qF（上游引物） TGATGTTACCACAAATGTTGTCTTC 内参基因 IC IC-qR(下游引物) CCTCTACATCTACCTGCTCAGACA 88 bp IC-qP(探针) Cy5-ATTCTACCTTGGGTGTAGTCTCCATGT-BHQ2 PCV2-dF(上游引物) GAARTGGTATYTGGGTGCCC PCV2 PCV2-dR(下游引物) ACTCCGTTGTCCTTGAGATC 133bp PCV2-P(探针) FAM-AGCSAAAGGAACAGATCAGC-BHQ1 PCV3-dF(上避引物) GTGCCGTAGAAGTCTGTCATTC PCR PCV3 PCV3-dR(下游引物) CAGGACAAAGCCTCTTCTTTTT 133bp PCV3-P(探针) HEX-ATAAATGCTCCAAAGCAGTGCTCC-BHQ1 EPC-F(上游引物) GCGATGGTCTCAACTCAACT 质控基因 EPC EPC-R(下游引物) CAAGGGTGTTCTGTGGTGAA 144bp EPC-P(探针) Cy5-ACCATOGAACATCTTTGCTGTCGC-BHQ2 注1：新合成的引物/探针干粉进行配制时，先将引物/探针贮存管短暂离心，然后开盖加纯水溶解，并稀释至 100mol/L后分装，20C避光保存备用. 注2：荧光标记，FAM、HEX、Cy5代表荧光报告基团，BHQ1BHQ2代表荧光摔灭基团，反应过程中选择相应的 荧光通道，过程质控基因探针Cy5荧光报告基团根据数字PCR仪器换用其他适配基团. 注3：R为含A和G的兼并碱基.Y为含C和T的兼并碱基.S为含C和G的兼并碱基. 6采样和制样 6.1采样 6.1.1根据GB/T18088确定采样动物数量. 6.1.2血液样品：通过前腔静脉无菌采血至抗凝管中. 6.1.3组织样品：无菌采集肺脏、淋巴组织和肾脏等组织样本. 3
